作者：Rosa Vanyan, Nataliya Dolgushina, Andrey Donnikov, Ekaterina Shubina, Natalia Usman*, Maria Kuznetsova and Gennady Sukhikh
俄罗斯联邦卫生部产科、妇科和围产医学研究中心
方法：共150名患者(65名卵巢响应性较差的女性作为实验组，85名正常卵巢的妇
女作为对照组)参加了这项回顾性病例对照研究。所有患者均按照卵泡刺激素和促性腺激素释放激素拮抗剂的标准使用方法给予卵巢刺激。基因分型是通过聚合酶链
反应及后续读取熔化曲线而得出的。统计检验均为双侧检验，百分比值利用χ2测试检验，关联性利用比值比计算。
不良卵巢反应(POR)是一个术语，表示在促性腺激素刺激过程中通过超声发现正在生长的卵泡数量减少(在这里并不涉及潜在的功能性问题，那将是另外一个 主题)。根据欧洲人类生殖和胚胎学会对POR定义的共识(博洛尼亚标准)，POR必须同时满足以下三个特征中至少两点：(一)高龄产妇(≥40岁)或任何 其他具体的风险因素，(ii)使用常规卵巢刺激方案只能得到≤3卵母细胞，及(Ⅲ)卵巢储备功能测试异常(ORT;即窦状卵泡计数少(AFC;小于 5–7)或血液中抗苗勒氏管激素水平低(AMH;< 0.5–1.1纳克/毫升))。例如，40岁以上并且有ORT异常的患者可以被分类为不良卵巢响应者(或预期POR);另一方面，如果一个患者有两次在接 受较大刺激后仍有不良卵巢响应的经历，则不论她是否高龄产妇或者是否有ORT异常，也可确诊该患者为POR [ 1 ]。在文献中POR出现的比率在9%至24%之间;此外，POR导致了50%被中止的IVF疗程，并且是更主要的降低IVF妊娠率的因素[ 2 ]。
共有150名患者(65名POR女性和85名有正常卵巢反应女性为对照组)参与了此回顾性病例对照研究。所有这些人都是从2012年9月到2014年8 月间在本产科、妇科和围产医学研究中心附属医院接受IVF治疗时被招募的。招募标准为：年龄在40岁以下，正常染色体核型、两侧卵巢完整，及无卵巢手术或 盆腔放射治疗史。因此，我们排除了总危险因素(第一位是年龄)，所以没有一个病人是受上述博洛尼亚标准第一条限制的。这一步很重要，因为BMP15基因仅 在发育中的卵母细胞中体现，在体内其它细胞中几乎没有体现，因此这么做可以将卵巢中一些病理过程作为本研究的中心，同时可以避免研究受到那些年龄导致的主 要器质性改变的影响。所有患者都签署了书面知情同意书，本实验被产科、妇科和围产医学研究中心的公共审查委员会所批准。
结果
在对 照组与POR实验组之间并无有关发病率和生育史的显着差异，但是POR组的患者比对照组的平均年龄要高(分别是34.7±3.9与 31.9±3.9，P<0.05，表1)并且有较长不孕不育的历史，以及较高的FSH水平和较低的AMH水平。超声检查发现与对照组相比，POR组 的女性大多都有卵巢储备功能较低的情况(卵巢体积减小和AFC≤5–7)(表1)。
参数POR组(n=65)对照组(n=85)p值
年龄(岁)34.7±3.931.9±3.9<0.0001
不孕历史(年)7.06±3.85.4±3.60.0078
FSH水平(IU/毫升)8.6±3.46.7±2.2<0.0001
AMH水平(IU/毫升)0.64±0.522.29±1.90<0.0001
显示低卵巢储备功能的样本数(人)53(81.5%)8(9.4%)<0.0001
怀孕数(人)12(18.5%)31(36.5%)0.0156
活胎数(人)8(12.3%)25(29.4%)0.0122
表1. 该表对比了不同实验组的年龄、激素水平、患者IVF周期的结果等。POR组比对照组年龄更大，并且有更长的不孕历史，及更高的FSH水平和更低的AMH水平。
七个BMP15 SNP等位基因出现的频率在表2中给出，非主要等位基因出现的频率范围从0.007到0.526。统计分析发现POR与一个外显子SNP (rs41308602)相关(c.308 A>G;该稀有G等位基因在POR组显著富集：POR组有三例该SNP的杂合性样本，而对照组没有发现该SNP，P<0.05;表3)。此外，POR也可能与SNP( rs3897937)有关(c.328 + 905 A> G;POR组中G等位基因出现的比例有所上升：POR为0.62，对照组为0.46，P≈0.05;表
3)。POR组中总共出现c.308G及c.328 + 905G的频率比对照组高了2.6±0.1倍，而其他已知SNP在两组间出现的频率并没有显著差异。
SNP位置NCBI(38.1)位置氨基酸替换核苷酸替换等位基因出现频率
rs41308602外显子段150911091Asn103Serc.308A>G0.020
rs138281369外显子段150910829Val16Metc.46G>A0.020
rs104894767外显子段250915966Ala180Thrc.538G>A0.013
rs104894763外显子段150910985Arg68Trpc.202C>T0.007
rs3897937内显子段150912016 c.328+905A>G0.526
rs796052131外显子段250916035Leu203Leuc.607C>T0.020
rs796052132外显子段150910775 c.-8delC0.040
表2. BMP15相关SNP的详细参数。
其中较下面的两个为本文章新发现的SNP，剩余SNP曾经出现在其它文献中。
外显子测序实验揭示了两个新的BMP15 SNP并被提交给了ClinVar数据库进行注册。它们分别是c.607 C>T(rs796052131)和C.-8单碱基缺(rs796052132)。其中，c.607 C>T替代仅在对照组中发现，因此它可能与保护卵巢功能有关。相比之下，在5’非编码区新发现的C.-8 delC单碱基缺失在POR组中较常见(表3)。
SNP等位基因出现机率等位基因χ2p值
POR(n=65)对照组(n=85)
rs413086020.046(n=3)04.0030.0454
rs1382813690.015(n=1)0.023(n=2)0.1240.7240
rs1048947670.015(n=1)0.011(n=1)0.0360.8481
rs1048947630.015(n=1)01.3160.2512
rs38979370.615(n=40)0.459(n=39)3.6210.0570
rs79605213100.035(n=3)2.3400.1260
rs7960521320.061(n=4)0.023(n=2)1.3850.2391
表3.新发现的变种rs796052131仅表达在对照组中，因此可能与保护卵巢功能有关。
与此相反，rs796052132则在POR组中出现的频率更高。
本实验还对rs41308602、rs3897937、rs104894763、rs138281369、rs104894767、和新发现的 rs796052131做了单倍型分析(都映射到BMP15外显子1或2，或其附近)。数据显示，在POR组中有可能发现该单倍型变体的几率比对照组高 2.7倍(表4)。鉴于曾经发现在卵巢刺激中rs3810682 / rs3897937单倍型与上升的卵泡数(≥12)有关[ 17 ]，我们也检查了三种常见SNP映射到外显子1或其附近的组合单倍型概率(rs41308602，rs104894763，和rs3897937)。同样 的，POR组的比值比高于对照组(表4)。
单倍型POR(n=65)对照组(n=85)比值比(95%置信区间)
rs41308602;rs138281369
rs104894767;rs104894763
rs3897937;rs796052131
0.7670.5502.7(1.25;5.96)
rs41308602;rs104894763
rs38979370.6760.4582.47(1.20;5.14)
表4. 变种相关的单倍型在POR和对照组出现的总机率。
讨论
结果表明，POR与两已知的BMP15变种有关联性：外显子SNP rs41308602(c.308A>G)和内显子SNP rs38979307(c.328 +905A>G)。c.308A>G替代导致相关蛋白103位点由蛋白丝氨酸变化为天冬酰胺。根据文献，在闭经患者和健康女性中都可以发现该G等位基因，但在闭经患者中的c.308 G更经常与G(c. - 9C > G)或T(c.852C >T)结合[ 18 ]。
c.328 +905A>G与卵巢功能的关系是有争议的。Hanevik等[ 19 ]发现POR样本中有更高频率的G等位基因，而Mendoza等[ 20 ]则发现携带有G等位基因及其它几个与卵巢老化相关的基因标记的女性会有更短的可生育期。Moron等[17]发现在对卵巢刺激有更高响应的患者中(包括卵巢过度刺激综合征的患者)，会有更高的几率出现c.673C>T、c.328 +905A>G和c.-9С>G的TGG单倍型。Gonzalez等[ 21 ]认为相比AA基因型而言，AG基因型可能起到保护作用并防止排卵障碍和不孕症。
与已发表的数据所预计的相反，在本研究中，三个其他已知的SNP与POR没有关联。比如，Di Pasquale等通过一个大的队列研究 [ 22 ]展示了卵巢早衰表型与两个BMP15变种有关联：c.202C>T→p.Arg68Trp及c.538G>A→p.Ala180Thr。尽管Ledig等[ 23 ]将c.538G>A归为多态性而非突变，他们在卵巢早衰患者和对照组中都发现了该变种。然而，C.538G/A杂合子比例在卵巢早衰患者中有所增加，并在几项研究中得到进一步证实[ 10,18 ]。在我们的实验中，两组患者中都发现了这些杂合子，表明G等位基因与POR无关。但是由于该实验采用了较小的样本数，该结论需要更多实验来验证。
只在对照组出现的的新变种c.607T没有氨基酸替代(对应亮氨酸的CTA改为同义的TTA)。总体而言，这些密码子在人类基因组上出现的频率大致相同 (约为每个人7%的亮氨酸基因总数)。不过，在卵巢中TTA特定的tRNA比CTA特定的tRNA更丰富[24]，且c.607C>T替代可能增加 局部BMP15 mRNA的翻译速率，从而影响蛋白生成。我们发现的新单碱基缺失变种c.-8 delC在POR组中比对照组更常见，并且位于BMP15 mRNA位点42的5’非翻译区。 它不干扰阅读框，但可能影响翻译的初始步骤。
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